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精细解读 | 灭菌法与细菌内毒素检查法应用指导原则--关于《中国药典》2020年版四部通则增修订内容(第四批)的公示

2019-03-13 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑研究院 浏览:
作者:雨花石
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权

 
编者按:国家药典委员会于2019年1月23日在官网发布了关于《中国药典》2020年版四部通则增修订内容(第四批)的公示,共4个征求意见稿。 本批公示稿中与微生物相关的重大修订,是“1421灭菌法”和“细菌内毒素检查法应用指导原则”。本次征求意见稿修订的内容较多,北京中仑工业微生物研究院针对此修订带来独家解读。 
备注:本解读目的只为制药业同仁能清晰了解修订内容做参考之用,其观点谨代表笔者!

 

1421-灭菌法 
 
  一、无菌保证的定义
  关于无菌保证,本次修订增加了“非无菌概率(Probability of a Nonsterile Unit,简称 PNSU)”的概念,替代了现有的描述“微生物存活概率”,并将无菌保证水平(Sterility Assurance Level, SAL)定义为PNSU不得高于10-6
 
  解读:PNSU的概念更为准确,且比“微生物存活概率”更易于理解。要使得物品达到无菌的要求,灭菌是一个极为重要的手段。理论上来说,经过灭菌后的产品,应没有活的微生物存在,方可满足“无菌”的要求。然而,灭菌动力学曲线研究表明,产品在灭菌时,微生物的下降呈如下规律:    
 
  logNt=logN0–△logN =logN0–F/D
  N0是灭菌前的微生物数量;Nt是灭菌后残存的微生物数量;F是灭菌时间;D是微生物的D值。
 
      由此可见,logNt与灭菌时间成负的线性相关。同时,随着灭菌时间的增加,Nt越来越接近0,却无法达到0,也即,真正意义上的无菌(绝对没有微生物)是不存在的。而10-6的PNSU(即微生物的残存概率为百万分之一)则为可接受的无菌保证水平。因此,引入PNSU的概念来描述无菌保证水平更为准确、直观。
 
  二、灭菌工艺控制的划分

  将灭菌工艺划分为灭菌工艺的开发(新增)、灭菌工艺的验证和日常监控三个阶段。
 
  解读:这一划分,体现了灭菌工艺从开发到验证,再到日常监控的完整的生命周期,同时对各个阶段的要求进行了描述,使得《中国药典》关于灭菌法的规定更具有科学性、结构化和可操作性。

  灭菌工艺的开发为新增的内容,包括三段的文字描述。


  灭菌工艺开发的第一段:规定了灭菌方法选择的基本要求,包括被灭菌物品的性质(物品的耐热性、稳定性、相容性等)、灭菌方法的有效性、灭菌后物品的完整性、经济性等因素,根据这些因素统筹考虑灭菌方法和灭菌参数。应优先选择最终灭菌法,若不可行,则选择无菌工艺。这一段落对于灭菌工艺的开发提出了具体的要求,制药企业只有科学的选择灭菌方法,制定合理的工艺参数,方可保证产品的无菌性和灭菌后产品的质量。

  灭菌工艺开发的第二段:描述了过度杀灭法、生物负载/生物指示剂法和生物负载法这三大灭菌方式。这一划分,与USP 1229系列保持了高度的一致。灭菌参数的设定,既要确保百万分之一的SAL,又要兼顾产品的耐热性和稳定性,因此,需要根据产品特性选择合适的灭菌参数。根据 logNt = logN0 – F/D这一公式,在确保logNt不超过-6这一前提下,在确定灭菌剂量(F)时,初始污染菌数(即微生物负荷,logN0)和微生物的耐热性(D)就尤为重要。基于这一基础,当产品耐热时,对生物负荷及耐热性作最坏的假设,即为过度杀灭法;当过度杀灭法不可行时,可根据被灭菌物品的微生物负荷和微生物耐热性选择合适的灭菌工艺,并在灭菌工艺验证和日常监控时,选择合适的生物指示剂(其耐热性大于被灭菌物品中的微生物),这一方式即为生物负载/生物指示剂法;如产品的稳定性较差,或者无合适的生物指示剂可用于灭菌工艺时,则选择生物负载法。其中,辐照灭菌法为典型的生物负载法。辐照灭菌无需选择生物指示剂(常见的灭菌方法,由于芽孢的热稳定性和化学稳定性,均选择芽孢作为生物指示剂,而这一基础对于辐照灭菌法不适用,因为灭菌物品中所负载的某些微生物可能比芽孢显示更强的抗辐照能力),其工艺开发、验证和日常监控,在ISO11137有详细的描述,并且ISO11737对于涉及到的测试方法也有详细的规定。
  
  
灭菌工艺开发的第三段:描述了微生物负荷控制的重要性,因其不仅影响灭菌效果,还会影响产品的质量,如杂质、内毒素等。

  
这三段文字所包括的信息极为重要,奠定了整个灭菌工艺在整个生命周期中的合理性、有效性和日常控制策略。
 
  三、湿热灭菌法
  1、增加了蒸汽-空气混合物、蒸汽-空气-水混合物的灭菌方法
  解读:对于密闭/密封的容器,容器内除了液体外,还会存在空气或惰性气体,其在灭菌过程中会发生膨胀,容器内压力增加,因此,在灭菌的时候需要考虑在灭菌介质中通入空气,以平衡容器内部的压力。
 
  2、删除了湿热灭菌的条件(如121℃、30min),替换为采用温度-时间参数或者结合F0值综合考虑。

  解读:根据前述灭菌原理的点评,这一规定更具有科学性。
 
  3、删除了“热不稳定性物品的F0值一般不低于8 分钟”

  解读:对于这一修订,笔者特别标出,并表示高度的赞同与支持。在2010版GMP无菌药品中,有“通常标准灭菌时间F0值应当大于8分钟”的规定,而在CDE发布的灭菌/无菌工艺验证指导原则(第二稿)中,也有“目前湿热灭菌方法主要有两种:过度杀灭法(F0≥12)和残存概率法(8≤F0<12)”的要求。因此,湿热灭菌F0值不低于8,似乎是一个必须的要求。

  比较:然而,与欧美药典相比,欧洲药典5.1.5和美国药典1229系列,关于无菌保证,均采用了SAL(或PNSU)不超过10-6的要求,至于如何达到这一要求,也即F0值最低为多少,均未作明确要求。并且在USP中,关于如何达到SAL,通过一系列的理论进行了阐述,透过这些理论,我们也不难看出F0值不低于8的要求是不合理的。

  再次引用灭菌动力学的公式,logNt = logN0–F/D,在这里logNt不超过-6即为我们的SAL。基于这一公式,F的值取决于初始污染菌数logN0和微生物的耐热性D。当前制药工业认为,初始污染菌数的最大值不超过106,而“很少发现自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分钟”(出自CDE指南),因此,logN0和D值均取最差条件(分别为106和1min)时,不难算出,当logNt为-6时,F0值为12min。这也是过度杀灭法F0值不低于12的原因。当产品不耐热,需要降低F0值时,如不影响SAL,则只能降低初始污染菌数logN0或降低微生物的耐热性(D值)。初始污染菌数的控制相对比较容易,可通过灭菌前过滤、物料、环境等进行控制,通常logN0不超过2是一个易于达到的、可以接受的水平。

  基于这一水平,微生物耐热性仍取最差条件(即D121℃为1min),此时,F0值即为8。这也成为了湿热灭菌法F0值的最低标准。然而,产品中的微生物负载的耐热性通常远低于1min,因此,可根据产品中实际存在的微生物耐热性,设置公式中的D值,从而保证百万分之一的SAL,从科学性上完全是合理的。

  这一概念,在PDA的TR1中举了具体的例子进行了分析(即根据产品特性,初始污染菌数为102,D值为0.4min,此时,要达到10-6的PNSU,F0值为3.2min即可),与USP的灭菌理论也高度一致。因此,F0 值不低于8min这一要求是不合理的。


  因此,在这一背景下,《中国药典》此处的修订,没有照搬GMP和CDE指导原则的相关要求,而是根据灭菌原理从科学性上进行了规定,并与欧美药典保持了一致。

  4、增加了蒸汽直接接触的灭菌法和液体灭菌法的相关描述
  解读:虽然同为湿热灭菌法,但两者有着很大的差异,在USP 1229系列中,分两个章节对这两种方法分别进行了讨论,其灭菌原理、灭菌工艺设计、灭菌验证、日常控制,甚至所适用的生物指示剂均有不同。通常情况下,蒸汽直接接触用于硬物/多孔类物品,这类物品热稳定性高,多采用过度杀灭法;

  而液体灭菌,其被灭菌物品稳定性相对较低,通常采用微生物负荷/生物指示剂法。前者一般F0值设定某一下限即可,而后者考虑到产品的稳定性,F0值不仅仅考虑下限,还需要考虑上限。再加上灭菌原理的差异(前者通过纯蒸汽接触后,蒸汽液化释放潜热进行灭菌,后者通过容器的热传递对液体进行加热),两者有着巨大的差异。
 
  5、装载方式,由先有的“不能过密”修改为细化的描述

  解读:新增内容要求评估被灭菌物品最大、最小、典型装载等不同装载模式对于灭菌有效性和重现性的影响。同时,在做装载热分布试验和装载热穿透试验时的注意事项,前者要求装载物品的选择需具有代表性,后者则要求温度探头的放置位点具有代表性。
 
  6、修订了微生物挑战试验的要求,包括生物指示剂的放置位置和生物指示剂的种类

  解读:生物指示剂的放置位点的选择,由当前的“冷点”修订为“应结合被灭菌物品的特点、装载热分布以及热穿透试验结果来确定”,规定更为合理。

  生物指示剂的种类,由现有的“嗜热脂肪芽孢杆菌”修订为“过度杀灭法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的芽孢,热不稳定性物品灭菌常用的生物指示剂为生孢梭菌(Clostridium sporogenes),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)。”

  
这一修订,可认为是当前规定的一种修正。嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热性很强,D值很大,对于某些生物负荷/生物指示剂的灭菌方式其实是不适用的,这些灭菌方式设定的F0值较小,对于灭菌前微生物负荷的数量和耐热性有着更为严格的要求和控制,要证明这些灭菌工艺能够达到百万分之一的SAL,相应的生物指示剂的数量和D值也需要与灭菌能力相匹配,因此,选择不同微生物种类的生物指示剂也更为科学。
 
  7、增加了对热不稳定的产品,须控制和监控灭菌前的微生物负载,特别是耐热菌的要求

  解读:热不稳定的产品采用通常采用生物负荷/生物指示剂或生物负荷的灭菌工艺,其F0值通常较小,要保证百万分之一的SAL,就需要对灭菌前的微生物数量、种类(耐热习性)进行控制和监控。
 
  8、增加了灭菌后冷却阶段须防止物品被污染的要求

  解读:物品灭菌后,在冷却阶段,灭菌物品内部和外部会存在温度差,从而出现压差的变化,导致灭菌物品内外部可能出发生气体的交换。此时,如控制不当,则可能导致灭菌后的物品被再次污染。容器密闭系统的密闭性、腔体内通入除菌过滤的空气等措施可防止物品被再次污染。
 

  四、干热灭菌法
  1、修改了干热灭菌法的灭菌条件
  解读:由当前的“一般为(160~170℃)×120min以上”等灭菌条件,修订为“干热灭菌法的工艺开发应考虑被灭菌物品的热稳定性、热穿透力、生物负载(或内毒素污染水平)等因素。”,“采用温度-时间参数或者结合FH值综合考虑”,并描述了干热灭菌和去热原的温度范围。此处修订与湿热灭菌修订的原则保持了一致,更具有科学性。
 
  2、装载方式,由先有的“不能过密”修改为细化的描述

  解读:此处修订,理由应该是与湿热灭菌法相同。
            
  3、增加了灭菌设备需要保持正压、进入的空气需经过过滤、过滤器须定期确认完整性的要求

  解读:对于生产设备,如隧道烘箱,由于西林瓶直接暴露于灭菌设备内,这些规定可防止灭菌(及去热原)后的设备被二次污染。对于实验室设备,考虑到被灭菌(去热原)物品的包装形式、用途等因素,这一要求建议放宽。
 

  五、辐射灭菌法
  1、修订了辐照灭菌的方法,修订了灭菌工艺开发、剂量设定、剂量审核和日常监控的相关内容
  解读:此处修订的内容,基本原则与ISO11137保持一致。其中,USP关于辐照灭菌的相关要求,也直接参考了ISO11137,因此,本次修订与欧美的辐照灭菌相关基本原则保持了一致。
 
  2、删除了辐照灭菌关于生物指示剂的规定

  解读:辐照灭菌是典型的生物负荷的灭菌法,其剂量的设定、审核及日常监控都不是基于生物指示剂进行的,因此,删除生物指示剂的规定更为合理。
 

  六、气体灭菌法
  1、气体灭菌的化学消毒剂,由“本法中常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧(O3)等”修订为“本法最常用的化学消毒剂是环氧乙烷”。
  解读:当前气体灭菌主要用的化学消毒剂为环氧乙烷,因此,本次修订体现了现实状况。然而,其他气体,如臭氧、二氧化氯等其他也可用于气体灭菌。可考虑将这些灭菌介质加入到《中国药典》允许的范围内。
 
  2、删除了气体灭菌的灭菌条件和灭菌流程,保留了其中关于灭菌腔室的密闭性、灭菌残留物的去除的要求

  解读:这一修订原则,与湿热灭菌、干热灭菌的修订原则保持一致。
 
  3、生物指示剂由“枯草芽孢杆菌”修订为“萎缩芽胞杆菌”

  解读:此处的内容修订与USP、ISO11138保持了一致。
 

  七、过滤除菌法
  1、过滤器完整性测试,由过滤前后均须进行,修订为过滤后进行
  解读:关于过滤器完整性测试是否需要在过滤前后均需进行,国际上有着不同的要求。而过滤后的完整性测试是确保除菌过滤是否有效的重要保障,如过滤后符合要求,则可确保除菌过滤是有效的。
 

  八、无菌生产工艺
  1、删除了无菌生产工艺的全部内容
  解读:无菌生产工艺不属于灭菌法的范畴,删除更为合理。
 

  九、汽相灭菌法
  1、新增了汽相灭菌法的内容
  解读:新增内容比较简洁,反应了《中国药典》对于汽相灭菌法的最基本的要求
  
  十、液相灭菌法

  1、新增了液相灭菌法的内容
  解读:新增内容比较简洁,反应了《中国药典》对于液相灭菌法的最基本的要求。
 

  总结
  本次灭菌法的修订,体现了国际化这一理念,新修订内容与当前欧美法规指南关于灭菌法的要求更为一致。
 


 
细菌内毒素检查法应用指导原则
 
  本章节为新增指导原则,是对细菌内毒素检查法的进一步说明。
 

  1、内毒素限值的设定
  点评:在药典关于细菌内毒素限值设定的基础上,增加了对联合用药、特殊人群、大输液、多规格注射液、原料药等在制定细菌内毒素限值的额外考量。其中,关于装量超过100mL的大输液,细菌内毒素限值规定一般不得超过0.50EU/mL。因此,在制定细菌内毒素限值时,对于指导原则适用的产品,需在细菌内毒素检查法的基础上,根据本指导原则,进一步考察标准的合理性。
 
  2、细菌内毒素方法的选择

  点评:规定可以选择药典收载的任何一种方法进行产品的内毒素检查。同时,指导原则比较了凝胶法和光度法的优缺点。光度法由于可以检测内毒素的含量,在过程控制、趋势分析方面有着明显的优势;同时,光度法的检测限范围更宽,因此,在凝胶法无法去除干扰活性时,光度法可作为替代的选择。
 

  3、供试品的前处理
  点评:描述了供试品前处理的基本要求,对于一些特殊的剂型,如微球、脂质体,规定“使包裹在内部的细菌内毒素完全释放,再进行检测”。
 

  4、细菌内毒素方法的建立
  点评:细菌内毒素检查法要求在建立细菌内毒素检查法时,须进行干扰试验, 并对干扰试验的设计和可接受标准进行了描述。本指导原则在此基础之上,提出了在建立细菌内毒素检查法时“应使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验”的要求。
 

  5、其他
  点评:描述了鲎试剂之间活性差异、MVD非整数、新的细菌内毒素检查法等内容,并将“重组C因子法”作为附件加入本章节。
 

  总结
  新增的指导原则是对细菌内毒素检查法的一个有效补充,便于制药企业更好地实施细菌内毒素检查法。
 
  《中国药典》是我国药品的法定质量标准,是公众用药安全的重要保障。近年来,《中国药典》与微生物相关的章节处于持续更新中,每一次修订,微生物检测和控制的要求则更为合理。此次灭菌法的修订,我们更加欣喜的看到,药典的修订不局限于条条框框之中,而是以科学性为基础,与国际化的理念保持一致,对制药行业科学的实施灭菌法具有更好的指导意义。
 
  虽然与欧美药典相比,《中国药典》起步较晚,与国外药典仍存在一定的差距。但是我们相信,通过药典委员会的不懈努力,在中国制药行业同仁的大力支持下,我们达到并超过欧美药典水平的时间相信不会太久。

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