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制药环境微生物检测风险及应对

2017-08-16 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑研究院 浏览:

作者:半知菌目
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权
 


 

  制药洁净环境中因为药物API的特殊性及洁净室清洁消毒时用到的各种消毒剂,对洁净环境中潜在的微生物有抑制或杀死的作用,对环境微生物监测会结果带来“假阴性”的风险,因此必须了解洁净环境中潜在的抑菌或杀菌物质及存在的单位数量,进而采取正确的培养基来监测环境中潜在的微生物,得出洁净环境中微生物的实际水平。

  中国药典2005年版就已经要求对微生物检验方法提出了验证的要求,即采用微生物检验方法时首先应该确认药品本身是否含有抑菌或杀菌成分,从而影响药品中可能的微生物检出,会得出一个“假阴性”结果。但时至今日,在药品生产环境微生物监测中,仍然没有要求首先确定制药环境中可能存在的抑菌或杀菌成分,进而在制定出有效合理的去除抑菌或杀菌成分后再进行环境监测,以避免出现“假阴性”的结果。
 
  
药品微生物检测中,“假阴性”的结果远比“假阳性”要可怕。
 
  对抗生素企业和部分制剂厂家来说,仅仅大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)和沙氏琼脂培养基(SDA)来监测洁净室的微生物则是不全面的。在抗生素生产企业,动态监测时其洁净室内不可避免地混杂着一定量的抗生素粉尘,如果没有采取能够消除抗生素粉尘对微生物生存和生长的影响的措施,就采用国标的方法测试该环境中的微生物,得到的监测结果,不可避免的将是一个“假阴性”的结果;同样,部分药物的API对个别微生物也有不同程度的抑制或杀灭作用,要是不消除这类影响微生物生存和生长的环境因素,同样会得到“假阴性”的结果。
 

  制药企业洁净环境中的抑菌成分主要有这样两大类:
  1、API残留;
  2、消毒剂残留。

 
  一、制药洁净室环境微生物监测风险一:
  API残留

  API主要分为这样两部分:
抗生素部分API

  消除抗生素粉尘的残留,采用的方法就是降解取样时落在培养基平板上的抗生素,在监测平板的培养基内添加一定量的酶对于β-内酰胺类抗生素,添加β-内酰胺酶(即青霉素酶);对于头孢类抗生素,则添加头孢菌素酶。如何在培养基中添加酶?
 
   而API的消除,则
主要依据:“中国药典”2015年版四部 附录1105表2:“常见干扰物的中和剂或灭活方法” 中所对应的中和或灭活方法,还有一个方法就是借鉴相关产品微生物检验方法验证中所采取的中和或灭活方法来消除API的影响。抗生素生产企业,在其生产环境中含有一定量的抗生素粉尘,这些抗生素存在的微生物有着抑制或致死的作用。抗生素生产环境的微生物监测,就是要着力消除抗生素对微生物的影响,从而还原出洁净室内微生物的实际状况。消除抗生素粉尘对微生物的影响,依据的原则是降解取样时落在培养基平板上的抗生素,在环境监测的取样培养基内添加一定量的酶,降解β-内酰胺类抗生素,添加β-内酰胺酶(即青霉素酶);降解头孢类抗生素,则添加头孢菌素酶。
 
  生物酶,其本质是蛋白质。酶表现出生物活性,与温度密不可分,酶活性最大的温度与人的体温接近,约37℃上下。而在37℃,含琼脂的培养基,如TSA等培养基在凝固之前加入酶,而且要混合均匀,这就注定了加酶的培养基平板的制做一定是一个工业化的生产过程,在TSA、SDA等培养基固化前的最低温度加时入生物酶,而且要持续匀速搅拌,使得酶与培养基充分混合均匀,再浇制培养基平板。
 
  确认每块平板中加那种酶,加多少活性单位的酶,是必须验证才可以得出数据。

 
  步骤:

  1、在这个环节应该注意:第一,选择抗生素环境沉降菌的监测点,一定选择的是“风险点”,而非物料暴露区域、粉尘浓度最大的“关键点”。例如,在抗生素无菌粉灌装头附近,即所谓的的“关键点”上的确是无菌物料暴露的关键区域,但也有极高的抗生素粉尘沉降。但是,这个关键点上存在的高浓度抗生素粉尘,也是细菌无法生存的环境,选择在这里监测细菌沉降意义不大,如有监测需要,充其量是监测霉菌和酵母菌的。而稍微远离灌装头,一来沉降的抗生素粉尘浓度稍低;二来这些部位往往会受到外界干扰,极易受到微生物的污染,因此,抗生素生产环境监测点的选择应该关注的是“风险点”。这一点是有别于非抗生素产品生产时环境监测的。

 
  2、在获取了监测点的抗生素含量后,确定加酶的种类和加酶量。理化实验室计算出平皿上的抗生素含量后,微生物实验室据此来确定降解抗生素的酶的种类,β-内酰胺类抗生素,添加β-内酰胺酶(即青霉素酶);对于头孢类抗生素,则添加头孢菌素酶。目前最新型的培南类抗生素,即碳氢烯类抗生素,则需要添加金属青霉素酶。加酶量的确认,就只有做系列的摸索试验了,分别制做不同酶含量的平皿,采用涂部法,做回收率试验,再与不加酶的培养基平皿做对照,最终选择各测试细菌回收率都合格的那个加酶平板的加酶量,确定为这个抗生素监测点上的加酶种类和加酶量。

  在这个环节应该注意,
选择的测试菌种,一定是该抗生素抗菌谱内的敏感菌和环境常见菌。

 
  3、抗生素粉尘量在抗生素生产环境里确定的沉降菌监测点,监测点上的抗生素粉尘降落量一般以不超过100微克为宜。如果抗生素粉尘量超过100毫微克,甚至更高,验证得出的数据也就仅仅有写论文的价值,丝毫没有应用于实际生产过程的微生物监测了。原因很简单,1000万单位/毫升的青霉素酶的市价格6-7元人民币。如果是因为沉降菌监测点选择不当,而导致的加酶的培养基成本高昂,就属于走了一条本不该走的弯路了。
 
  4、上述试验完成后,该试验即列入该培养基的质量标准SOP中,测试项目名称为:酶活性测试以下例1、2、3可供参考。
 
  二、制药洁净室环境微生物监测风险二:
  消毒剂残留

  制药企业洁净环境每天都在使用消毒剂,怎样确定残留的消毒剂没有影响微生物的生长?选择什么样的培养基可以最大限度的衡量洁净室表面的微生物水平?理论知识告诉我们,卵磷脂、吐温-80组合后能够消除季胺类化合物(苯扎溴铵、苯扎氯铵等)消毒剂的影响;卵磷脂、吐温-80和L-组氨酸组合后能够消除醛类(甲醛、戊二铨等)和酚类(苯酚、间苯二酚等)消毒剂的影响;硫代硫酸钠能够消除卤素类消毒剂(碘伏、碘酒等)的影响等等。
 
  现在,国外制药企业环境微生物监测时,用于洁净室表面取样的培养基大多为大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基(即TSAWLP)。选择这样的培养基就可以有效的降解可能残留在洁净室表面的消毒剂(主要是季胺类化合物消毒剂)的残留。
 
  不解的是,国内有些企业在没有搞明白洁净室消毒剂的种类和残留量时就纷纷采用大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基用来监测洁净室表面微生物水平。要知道,大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基中所含有的卵磷脂+吐温-80是定量的,这就意味着,使用这款可以消除消毒剂残留的培养基,所能够降解的消毒剂残留必定是在一个规定限度以内的。所以,在没有确认所使用的季铵盐类消毒剂的残留限度,就盲目采用,同样会产生“假阴性”结果。
 
  更为不解的是,有些制药企业在清洁消毒时根本就没有用到季铵盐类的消毒剂,就盲目采用大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基(即TSAWLP)用于监测洁净室表面的微生物,令人费解。

 
  因此,洁净室表面微生物监测使用大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基(即TSAWLP)的前提必然是第一,洁净室有用到季铵盐类消毒剂;第二,按照洁净室清洁消毒标准操作规程洁净室清洁消毒之后,洁净室表面可能存在的消毒剂残留,一定在所使用的培养基所包含中和剂的降解范围之内,这点就需要验证数据支持了,也就是说,使用大豆酪蛋白+卵磷脂+吐温-80琼脂培养基(即TSAWLP)做表面微生物监测,一定要有验证数据支持的。

 
  结语:洁净环境微生物监测,必须在消除了洁净环境中存在的抑菌或杀菌物质后,才可以监测出洁净环境中微生物的真实水平,避免出现“假阴性”结果。

  案例一、

  案例二、

  案例三、
            
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