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液体湿热灭菌微生物负载的耐热性测试

2019-09-17 分类:原创文章 作者:Array 来源:CIMI 浏览:
作者:雨花石
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权
 
编者按:液体的湿热灭菌效果取决于多个因素,其中微生物负载的控制,包括微生物负载的数量和耐热性起着关键的作用。本文主要介绍耐热菌控制在无菌保障中的作用,USP耐热性测试方法及其关键考量。


  一、灭菌工艺原理
  灭菌在无菌产品的无菌保证中起着重要的作用。终端灭菌药品需要在产品及其密封组件组装完成后进行灭菌,以保证产品的无菌性;非终端灭菌产品需要将产品、密封组件等预先进行灭菌,再在无菌生产环境中进行组装,从而达到无菌的效果。因此,这两种无菌工艺都需要有效的灭菌工艺去除产品及其密封组件中的微生物,以保证药品的安全性。
 
  湿热灭菌是药品生产中最为常见的灭菌工艺。根据灭菌介质的不同,通常有蒸汽灭菌和过热水灭菌。蒸汽灭菌又根据被灭菌物品的性质,分为蒸汽直接接触灭菌和液体灭菌。蒸汽直接接触灭菌通常用于固体/硬物(Porous/Hard Goods),其主要的灭菌原理是基于蒸汽冷凝释放的潜热加热杀灭微生物,因此,其灭菌介质通常是饱和蒸汽,且蒸汽的质量(包括干燥度、过热值和不凝性气体)起着关键的作用。液体灭菌则是采用饱和蒸汽或蒸汽/空气混合物进行灭菌,其主要是通过热传递,将灭菌介质的温度通过容器再传递至被灭菌的液体。蒸汽的饱和度在液体灭菌过程中不是关键参数,甚至对于密闭容器的液体灭菌,需要在蒸汽中通入一定量的空气,增加灭菌介质的绝对压力,以平衡被灭菌液体容器中存在的气体因加热膨胀而增加的容器内部的压力。
 
  关于湿热灭菌的动力学及计算公式,USP的1229系列和PDA的1号技术报告有着极为详尽的阐述。笔者也曾在宝录生物的公众号“生物指示剂详解-理论篇”(2018年4月8日)一文中,关于D值、Z值、F0值等关键参数进行过介绍和推导,本文不再赘述。根据推导:
 
  lgNF= lgN0–t/DT
  其中:NF为灭菌后残留的微生物数量。无菌保证水平(SAL)的水平通常为百万分之一,即PNSU为10-6,此时NF即为10-6
  N0为灭菌前的微生物负载的数量。
  t为温度为T时的灭菌时间。当T取121.1℃时,灭菌时间t即为F0
  DT为温度为T时的D值。
 
  由公式可知,PNSU取决于微生物负载(包括数量N0和耐热性DT)和灭菌时间t。同时,当PNSU确定(即无菌保证水平取百万分之一)时,灭菌工艺(一定温度下的灭菌时间t)取决于微生物负载的情况(包括数量N0和耐热性DT)。
 
 
  二、湿热灭菌工艺的选择
  湿热灭菌工艺的选择需要平衡被灭菌产品的无菌性和稳定性。灭菌温度越高、时间越长(也即F0值越大),被灭菌物品的无菌保证水平越高,但是这对于产品的稳定性影响越大,反之亦然。对于固体/硬物而言,由于其对湿热灭菌的耐热性较好,通常采用过度杀灭法;而对于液体而言,则需要根据液体的耐热性选择合适的灭菌工艺。对于耐热性好的液体,应使用过度杀灭法,而对于耐热性较差的液体,则需要根据产品性质选择合适的灭菌工艺。新版欧盟的决策树(Guideline on the sterilisation of the medicinal product, active substance, excipient and primary container)体现了这一理念:
 

 
  三、液体产品湿热灭菌中的微生物负载控制
  对于耐热性液体产品而言,通常应采用过度杀灭法(Over Kill),此时,F0值应大于12分钟(欧洲药典的参考灭菌工艺应不低于15分钟)。这种灭菌工艺是基于微生物负载的数量和耐热性(D值)均取最差条件设计的,因此,在日常生产过程中,对于微生物负载数量和耐热性(D值)的检测不是必须的。而对于不耐热的液体的灭菌,则应采用残存概率法,此时,灭菌工艺(F0值)是基于被灭菌产品的微生物负载的数量和耐热性(D值)进行设计的,因此,在日常生产过程中,需要对被灭菌产品在灭菌前的微生物负载进行控制并进行测试,以确保其数量和耐热性未超过灭菌工艺设计的范围,从而确保灭菌效果,保证产品的无菌保证水平。
 
  根据USP的1229系列,基于微生物负载的不同,残存概率法又分为了Bioburden和Bioburden/BI两种方法,前一种方法完全基于被灭菌产品在灭菌前的微生物负载的数量和耐热性(D值)进行设计;后一种则是基于微生物负载的数量以及生物指示剂(微生物负载的耐热性应超过相应的生物指示剂)进行设计。无论哪种方式,都应确保被灭菌物品的耐热性不得低于灭菌工艺设计的范围。
 
 
  四、微生物负载的耐热性测试-Boil Test
  关于微生物负载的耐热性测试,也即D值的测定,工业界比较常用的是D值测定法,即通过专门的D值测定仪测定微生物的耐热性。根据ISO18472的规定,D值测定仪的测试范围超过了绝大多数微生物负载的耐热性范围,同时其成本太高,用于日常微生物负载耐热性的监控也不经济。因此,限制了其在微生物负载耐热性测试中的运用。
 
  USP1229.2介绍了一种微生物负载耐热性的测试方法,即Boil Test的方法。这种方法将纯的微生物培养物在100℃度下加热不同的时间,以确认微生物负载中是否有耐热菌,如有,根据加热后残存的微生物数量计算其在100℃下的D值,并根据表格换算为其在121℃下的D值,以确认其耐热性是否超过灭菌工艺设计的范围:
 

 
  USP1229.2提供了一种经济、快速的微生物负载耐热性的测试方法。然而,这种方法缺乏足够的细节,笔者根据文献报道,就以下关键点进行讨论:
 
  ▍测试用溶液的选择
  微生物的耐热性不仅仅取决于微生物本身的特性,还取决于其所处的环境。相同的微生物如处于不同的环境中,其D值会发生变化。如《药品生产验证指南》所述:
 
 
  嗜热脂肪芽孢杆菌在相同温度、不同介质下,其D值有很大差异。因此,Boil Test应优先选择产品溶液进行测试。
 
  ▍测试的温度
  Boil Test是采用液体加热煮沸的方式进行的。USP中默认的温度为100℃。然而,由于各地海拔高度的不同、液体种类的不同,因此沸点也会存在差异。在进行此测试时,需要确认测试时的具体温度。
 
  ▍测试的时间
  USP中规定了不同的测试时间(加热时间),对应的测试结果可以换算为121℃下的D值。在进行测试时,可根据灭菌工艺设定的微生物负载的D值、历史的微生物负载污染状况设置适合的加热时间。
 
  ▍测试微生物的状态
USP规定用纯的培养物进行Boil Test。通常微生物的营养体耐热性较低,而芽孢的耐热性较强。根据文献报道,对于不同的产芽孢微生物,其在营养体和芽孢的状态下,当D值为10分钟时,其在营养体所需要的温度范围约为40-72℃,而在芽孢状态下时,则为75-121℃:
 
  备注:CDT为营养体时D值为10分钟的温度,SDT为芽孢时D值为10分钟的温度。
 
  因此,如使用营养体进行Boil Test,极有可能将芽孢误判为非耐热菌。
 
  ▍培养基和培养条件的选择
  在Boil Test中,耐热菌芽孢需要经过萌发、生长繁殖和形成菌落等步骤,其中培养基和培养条件的选择起着重要的作用,尤其对于受损伤的芽孢。而这一过程又与芽孢的种类、行程过程、损伤状态等多种因素相关。因此,目前常用的培养基和培养条件能否有效的复苏微生物负载中的耐热菌是一个值得深入探讨的话题。
 
 
  五、总结
  USP1229.2提供了一种简易、快速的微生物负载耐热性测试方法,大大提高了微生物负载耐热性的测试效率、减少了测试的成本。然而由于USP中的描述不够详细,在使用该测试方法时,需要根据实际情况制定适合于产品溶液的测试方法。同时应考虑耐热性测试所用的培养基和培养条件。
 

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