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基于分子生物学的菌株分型技术研究进展

2019-03-18 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑研究院 浏览:
作者:广东省药品检验所/林铁豪博士
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权

 
编者按:2020年版《中国药典》对微生物鉴定指导原则进行了修订,并公开征求意见。此次修订包含了基因鉴定的内容,并强调了其在微生物异常结果调查中的作用。今天,广东省药品检验所林铁豪博士带来了各基因鉴定和菌株分型技术原理的介绍,比较了各技术之间的优缺点,从而帮助制药选择合适的菌株分型和溯源方法。
 
  基于分子生物学的菌株分型技术研究进展
 
  微生物数据偏差(MDD)是指微生物实验室出现不合规范的结果,属于偏差的一种,美国FDA的一个微生物试验专门工作组于2001年首次提出该概念,将微生物数据偏差与化学检验项目的OOS区别开来。
 
  法规情况
  2010版GMP增加了“偏差调查”与“纠正措施和预防措施”等质量风险管理手段,如第二百二十四条规定质量控制实验室应当建立检验结果超标调查的操作规程。调查需要有相应的记录。而2020年版《中国药典》<9203 药品微生物实验室质量管理指导原则>征求意见稿也明确指出检验过程出现与微生物相关的不合规范的数据,均属于微生物数据偏差。对实验室偏差数据的调查,有利于持续提高实验室数据的可靠性。USP41<1113>microbial characterization, identification and strain typing 中也有与关于菌株溯源分型的表述。

 
  无效OOS调查不彻底,尤其是微生物数据偏差(MDD)调查分析不彻底导致的企业GMP检查不合格在近期呈现明显增长的趋势。微生物偏差调查的重要性以及如何开展微生物偏差调查成为了困扰企业的现实难题。2020版《中国药典》<9204 微生物鉴定指导原则>征求意见稿提示采用合适的鉴定及菌株分型技术建立基于企业生产环境及检测环境分离菌株数据库是进行溯源分型及数据偏差调查的核心要素。其中由于基于分子生物学技术的基因鉴定分型技术由于其鉴定及分型的稳定性,准确性。被推荐用于企业的污染溯源分析及偏差调查。
 
  目前常用的基于分子生物学的菌株分析技术: 脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE) 分型、限制性片段长度多态性(Re-striction Fragment Length Polymorphisma, RFL P) 分型、随机引物扩增DNA 多态性(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 分型、自动化核糖体(Automatic Ribotyping)分型、重复序列技术( rep- PCR)分型、多位点序列分型(Multi-Locus Seguence Typing, MLST )等技术在食品微生物分析中应用比较广泛,但在药品微生物菌株分型中应用仍较少,本文通过对这些技术进行了阐述和比较,以期企业能够根据实际情况,选择合适的菌株鉴定及分型技术。
 
  一、PFGE菌株分型技术
       1984 年Schwartz等创立的PFGE技术,其原理是将致病菌DNA 经限制性内切酶消化后,获得5~20条DNA片段(10~700 kb),根据电泳条带不同形式对其分型。该技术以其独具的对大片段DNA分子的高分辨率而显著提高细菌分型的可靠性。PFGE 能检测染色体上所有酶切位点的变化,分辨率高,可反映全部基因的相关性,提供可靠的基因分型依据,是目前分子分型方法的金标准[1.2]

 
       Fujino等对61 株金黄色葡萄球菌进行分子流行病学研究[3],用PFGE分型结合凝固酶分型,结果PFGE分为11型,凝固酶分为4型。2003年,8个欧洲国家的10家实验室建立了可用于各实验室间PFGE结果比较的统一的PFGE实验技术及第一个代表流行性金黄色葡萄球菌的欧洲数据库。
 
       E. John Threlfall[4]等用PFGE 方法对一次国际性的阿贡纳沙门氏菌感染暴发疫情进行调查研究,通过PFGE发现来自英国(46株分离自病人、2株来自犹太风味小吃)、以色列(9株分离自病人、2株来自犹太风味小吃)和美国(10株来自病人)的菌株都属于相同的PFGE型,推断该致病菌来源于犹太风味小吃。在一项肠炎沙门氏菌的基因分型和流行病学研究中,研究者发现PFGE比常规的生化分型提供了更高水平的分辨率[5]
 
  二、RFLP菌株分型技术
  RFLP是指如果DNA 序列中的某个碱基发生了突变,使突变所在部位的DNA 序列产生(或缺失) 某种限制性内切酶的位点,利用该限制性内切酶消化此DNA,便会产生与正常不同的限制性片段,即在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型,据此揭示DNA碱基序列组成的异同。它是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用,现已被广泛应用于基因组遗传图谱构建,基因定位以及生物进化和分类的研究。Suthienkul 等[6]用RFL P分析了137株副溶血性弧菌的耐热性溶血毒素( TDH)和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素( TRH),结果显示,用Hind Ⅲ酶切后,TDH能分为5型,而TRH分为4型。

 
       虽然RFLP分析不受杂交方式的制约,标记之间无干扰,但是该法只能在内切酶识别位点上的变异才能检出,因而揭示的多态性不够多,且涉及同位素的应用和Southern杂交,操作复杂耗时,所需DNA 量大,因而限制了其在流行病学上的应用。
 
  三、RAPD菌株分型技术
  1990年,Williams等创立了随机扩增DNA多态性(RAPD)分型方法,Welsh等将其用于细菌的基因分析。即在相当低的退火温度下,采用单一引物非特异性地识别细菌染色体上的相应位点,使之发生多位点结合,结合位点可存在于2条DNA链上,相互间的距离从几百到几千个碱基不等,这些碱基序列经PCR扩增电泳,产生的多态性产物遵循孟德尔遗传定律,即同源片段的数目与样本之间的亲缘关系成正相关,同源片段越多,表明亲缘关系越近。故根据指纹图谱多样性进行分型,我们可分析物种间亲缘关系或是不同种基因间的差异。目前常选引物有KpuR、PBs、ERICI、ERIC等多条9~10个碱基的任意引物及20个碱基左右的单条或双条引物。

 
        Cetinkaya 等[7]用此方法对外科暴发流行的金黄色葡萄球菌进行分型研究,证实RAPD是一种简单快速的分型方法。该方法无需了解待测基因组的碱基序列,不受DNA 限制性内切酶的限制,具有灵敏、快速、重复性好的优点,但不同实验条件对结果有影响,因此必须对实验条件进行严格控制,确定最佳反应条件。
 
  四、核糖体菌株分型技术
  Grimon 等于1986年首次报道了rDNA 指纹图,该法又称rRNA 基因限制性图谱或核糖分型。rRNA 是细菌进化过程中最为保守的基因,在细菌染色体上可存在多个拷贝,以rRNA 基因片段为探针检测被限制性内切酶消化后的染色体DNA,可用一个探针分型多种细菌。核糖分型因其重复性高、分辨力强、易于解释分析和现已完全自动化等优点而被认为是一种有效的基因分型方法。核糖分型提供了一个能对多种细菌进行分类鉴定和分子流行病学研究的通用方法,可以追踪传染病的传染源和传染途径,也可对菌株间包括无流行关系的菌株间的相关性进行统计分析,以推断其亲缘关系。此法可用于近缘菌株的鉴别,已在分子流行病学研究中广泛应用。

 
       Riboprinter仪是根据分子生物学的基本原理,经灭活、酶切、杂交、成像等自动化程序,对细菌核糖体进行指纹图谱分析的自动化设备。在对原始图谱进行标准化分析处理时,以85%的相似度为界,与Riboprinter数据库内的ATCC 标准菌株图谱进行比对,使大量的细菌学鉴定分型步骤获得同步化、标准化, 排除了人工操作差异的干扰。杨捷琳[8]等对2003~2007年进出口食品及饲料样品中分离的29株沙门氏菌株进行了自动化核糖体分型, 29个样品中来自澳大利亚的16株,秘鲁4株,泰国4株,美国、厄瓜多尔各2株, 中国台湾1株。结合样品来源地域进行分析发现,来自同一地区的样品分离株在聚类分析时距离较近,相似度较大。并初步建立了口岸的沙门氏菌核糖体分型数据库。刘秀梅[9]等对中国2003 年和2004 年不同地区食品中污染的沙门氏菌株进行了分子分型及分布研究, 并初步建立了食源性沙门氏菌分子分型数据库, 研究结果发现, 我国部分食源性沙门氏菌分离株的核糖体型有一定的地域相关性和时间的连续性。
 
  五、rep – PCR菌株分型技术
  重复序列技术( rep - PCR)是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物的靶序列进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,即可分析菌株间基因组存在的差异。常用的基因外重复回文序列PCR(REP - PCR)和肠杆菌科基因间重复序列为引物的PCR(ERIC-PCR)都属于rep-PCR。它是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列,包括常用的基因外重复回文系列(REP)、肠杆菌科基因间重复序列(ERIC) 和BOX, 通过电泳条带比较分析, 揭示基因组间的差异。由于这些短重复序列在菌株、种、属水平上分布有差异以及进化过程有相对保守性, 通过比较DNA 图谱既可对各种微生物进行快速分型及鉴定, 又可对其进行DNA 水平上的遗传多样性分析。
Wong 等[10]用REP-PCR将1993-1995年在台湾分离的40株副溶血性弧菌流行株分为27个型,其中P 型占主导(12.2%),文章还显示, REP-PCR的分辨率虽比不上ERIC-PCR,但其重现性较佳。
 
  六、MLST菌株分型技术
  MLST 首先选定目的基因组的数个管家基因位点,针对各基因位点设计相应的PCR扩增引物,扩增各自的管家基因片段,扩增的产物纯化并测序,进而给每个基因位点指定相应的等位基因数值,各管家基因位点的等位基因数值共同构成一个等位基因谱,从而命名相应的序列型。MLST使用的序列测定技术,较其他的分型方法更明确,使得不同实验室间的结果具有高度的可重复性及可比性。MLST技术实现了序列数据可以真正交换及共享,这种优势是其他方法无法比拟的。

 
        Kotetishvili M[11]等将MLST用于沙门氏菌分离株,7个看家基因包括arcC、thrA、purE、dnaN、sucA、hisD 和hemD,结果表明,MLST 为沙门氏菌分型提供优于血清分型和PFGE的分辨力。Harbottle等比较PFGE和MLST对纽波特沙门氏菌分离株的分型结果,认为MLST 是一种有着更高分辨力,能让人了解流行病学上不相关菌株的进化关系的分型方法,这一点正是PFGE技术无法达到的。近几年,MLST技术发展到除了以看家基因的PCR扩增,还以毒力基因等基因的PCR 扩增来进行。
 
       金黄色葡萄球菌内部的7个看家基因为arcC、aroE、glpF、gmkptatpi yqiL,Aires de Sousa 等[12]用此方法结合其他方法证实了一个金黄色葡萄球菌克隆在台湾流行至少5年。MLST 适合长期大范围的流行病学调查研究。但由于是根据基因序列进行分型,少数核苷酸序列的不同就会导致型别不同,因此技术要求严格。
 
  总结
  目前,上述所介绍的六种方法已经广泛应用于溯源分子分型中,但各种方法均有其不足的地方,比如:

  ◆ RAPD操作简单,但重复性稍差;
  ◆ RFLP操作繁琐,分辨力较低,检测周期长,不适于大规模检测;

  ◆ rep-PCR的重复性较差,不利于实验室间交流共享数据;
  ◆ PFGE和核糖体分型方法较为成熟,但过程繁杂,耗时较长,对人员要求较高;
  ◆ MLST依赖基因测序, 方法成本较高。
 
  企业根据自身实际情况选择合适的菌株分型技术,综合考虑微生物生理学、形态学、血清学或生态学资源等多层信息进行微生物分类及菌株分型,并形成企业生产环境及检验环境菌株数据库,有助于企业开展微生物偏差调查分析,持续提高实验室数据的可靠性进而提高产品质量。


 
参考文献
[1] Chiou CS ,Wei HL ,Yang LC. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and coagulase gene restriction profile analysis techniques in the molecular typing of staphylococcus aureus [J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (6) : 21862 2190.
[2] Blanc DS , Struelens MJ , Deplano A , et al . Epidemiological validation of Pulsed-field gel electrophoresis patters for methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J ] . J Clin Microbiol ,2001 ,39 (10) :344223445.
[3] Fujino T,Mori N , Kawana A ,et al . Molecular epidemiology of methicillin2 resistant Staphylococcus aureus in a Tokyo Hospital in 2001[J ] . Jpn J Infect Dis ,2001 ,54 (6) :2402242.
[4] John Threlfall E,Michael Hampton D, Linda Ward R, et al. Application of Pulsed-Field Gel Electrophoresis to an International Outbreak of Salmonella agona [J]. Emerging Infectious Diseases, 1996,2 (2): 435-438
[5] Steve Yan S., Michael L, Pendrak, Ph.D, et al. An overview of Salmonella typing Public health perspectives [J]. Clinical and Applied Immunology Reviews,2003,4: 189-204
[6] Suthienkul O , Iida T , Park KS. Restriction fragment length polymorphism of the tdh and trh genes in clinical Vibrio para2 haemolyticus strains [J ] . J Clin Microbiol , 1996 ,34(5) :12932 1295.
[7] Cetinkaya Y, Kocagoz S , Hayran M, et al . Analysis of mini2outbreak of methicillin2resistant Staphylococcus aureus in a surgical ward by using arbitrarily primed2polymerase chain reaction[J ] . J Chemother ,2000 ,12 (2) : 1382144.
[8] 杨捷琳,袁辰刚,顾鸣,韩伟 进出口食品及饲料中沙门氏菌Ribotype 分型研究[J ]. 检验检疫科学, 2007 Vol.17
[9] 刘秀梅,周正,郭云昌 食源性沙门氏菌分离株自动化核糖体分型的研究[J ]. 中国食品学报 2006, Vol. 6 No. 2
[10] Wong HC, Lin CH. Evaluation of typing of Vibrio parahaemolyticus by three PCR methods using specific primers [J]. J Clin Microbiol,2001, 39 (12): 4233-4240.
[11] Kotetishvili M, Morris JG , Sulakvelidze A, et al. Multi-locus sequence typing for characterization of clinical and environmental salmonella strains [J]. Clin Microbiol,2002,40: 1626-1635
[12] Enright MC , Day NP , Daries CE , et al . Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and ethicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus[J ] . J Clin Microbiol ,2000 ,38 (3) :100821015

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