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微生物方法学开发与适用性试验--从理论到实践

2018-09-02 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑研究院 浏览:
作者:广东省药品检验所/林铁豪博士
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权

编者按:2015年版《中国药典》实施已近三年时间,有关微生物方法学开发和适用性试验的问题仍层出不穷,其中以微生物限度检查法为最。如疑难品种供试液的制备、菌液的加入方式、抑菌性的消除、组别的设置等等...各类问题不一而足。CIMI官微“微生物研究院”特邀广东省药品检验所林铁豪博士撰稿,对2015年版《中国药典》微生物限度检查法的方法开发和适用性通过案例分析,详解方法开发思路和适用性试验规范。

 
  前言
  去除药品的抑菌活性是药品微生物限度检查方法适用性试验的重点和难点,如何判定抑菌性是否被去除是保证方法有效性和科学性、避免假阴性结果出现的重要环节。2015年版药典对计数方法中“实验组”的设置与前两版药典不同,对实际工作程序、操作技术有较大影响。
 
  本文从一例水不溶性非油脂类样品方法适用性开发实例出发,重点介绍方法适用性试验开发策略及注意事项。

 
  一、供试液制备
  取本品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,振摇使分散,静置5分钟,取上清液作为1:10的供试液。取1:10的供试液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,摇匀,作为1:100的供试液。取1:100的供试液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,摇匀,作为1:1000的供试液。
 
  
注1:中国药典2105版在抑菌活性的去除方面删除了离心沉淀法,因离心沉淀法同样能将吸附有微生物的颗粒及悬浮微生物沉积到离心管底部,影响微生物检出,所以各国药典均未收载该方法。由于样品属于水不溶性非油脂类供试品,制成的1:10的供试液的不溶性颗粒会堵塞吸管口,难以吸取,故将供试液静置5分钟,取上清液作为1:10的供试液。
 
  注2:稀释度依据样品特性,质量标准制定。《9202非无菌药品微生物限度检查指导原则》中指出如供试品应符合的微生物限度标准是1g需氧菌总数不得过10³cfu,那么最高稀释级是1∶10³。

 
  二、 需氧菌总数计数方法适用性试验
  目录
  1、需氧菌总数预试验一:枯草芽孢杆菌 1:10供试液,膜过滤法
  2、需氧菌总数预试验二:枯草芽孢杆菌 1:100供试液,膜过滤法
  3、需氧菌总数 1:1000供试液,平皿法

 
  1、需氧菌总数预试验一
  枯草芽孢杆菌 1:10供试液,膜过滤法

 
  试验组:取1:10供试液各10ml,置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,各取1ml,加至pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中,摇匀,过滤,分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗2、4、6次,每次100ml,滤干,取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上,培养,测定试验组的平均菌落数。
 
  菌液组:取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,加至pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中,摇匀,滤干,取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上,培养,测定菌液组的平均菌落数。
 
  供试品对照组:取1:10供试液,以稀释液代替菌悬液同试验组操作,测定供试品对照组的平均菌落数。
 
  注1:考虑本品的抑菌成份,结合本品的抑菌谱,故预试验菌株用枯草芽孢杆菌。

  注2:所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。

  注3:严格控制加菌量使含菌量每1ml不大于100cfu。可使用经过验证的商品化菌株定量小球。

 
  实验结果:

  各菌株回收比值=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。

  结果见表1

 
 
 
  由表1可见,取1:10的供试液,采用薄膜过滤法,冲洗量为600ml,不能消除本品对枯草芽孢杆菌的抑制作用,该方法不适合该品种的需氧菌总数检查。
 

  注1: 根据《9202非无菌药品微生物限度检查指导原则》,“进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验”。故采用1:100的供试液进行下一个预实验。

 
  2、需氧菌总数预试验二
  枯草芽孢杆菌 1:100供试液,膜过滤法

 
  试验组:取1:100供试液各10ml,置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,各取1ml,加至pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中,摇匀,过滤,分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗6、8次,每次100ml,滤干,取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上,培养,测定试验组的平均菌落数。

  菌液组:取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,加至pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中,摇匀,滤干,取出滤膜,菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上,培养,测定菌液组的平均菌落数。

  供试品对照组:取1:100供试液,以稀释液代替菌悬液同试验组操作,测定供试品对照组的平均菌落数。
 

  实验结果:

  各菌株回收比值=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。

  结果见表2
  
 
  由表2可见,取1:100的供试液,采用薄膜过滤法,冲洗量为800ml,虽然回收率较预实验一有所提高,但仍达不到药典要求的回收率比值在0.5-2.0之间。不能消除本品对枯草芽孢杆菌的抑制作用,该方法不适合该品种的需氧菌总数检查。
 

  注1: 根据《9202非无菌药品微生物限度检查指导原则》,“进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验”。故采用1:1000的供试液进行下一个预实验。

 
  3、需氧菌总数 1:1000供试液,平皿法
  由于1:100薄膜过滤法实验表明能部分去除掉样品的抑菌性,故1:1000供试液实验就直接五个实验菌一起开展并从较为简单的平皿法开始。
 

  试验组:取1:1000的供试液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的各试验菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,置平皿中,注入胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml,混匀,待凝固后,倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿,测定试验组的平均菌落数。

  菌液组:取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的各试验菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,置平皿中,注入胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml,混匀,待凝固后,倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿,测定菌液组的平均菌落数。

  供试品对照组:取1:1000的供试液,以稀释液代替菌悬液同试验组操作,测定供试品对照组的平均菌落数。
 

  实验结果:

  各菌株回收比值=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。

  结果见表3

 

  由上表3可见,取1:1000的供试液,用平皿法时,各菌株3次试验的回收均在0.5~2范围内,因此本品的需氧菌总数可用平皿法检查(即1:1000的供试液,1ml/皿)。

  三、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验
  试验组:取1:10的供试液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的各试验菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,置平皿中,注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml,混匀,待凝固后,倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿,测定试验组的平均菌落数。

  菌液组:取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液各10ml,分别置灭菌试管中,加入每1ml含菌量为103~104cfu的各试验菌悬液0.1ml,使含菌量每1ml不大于100cfu,摇匀,取1ml,置平皿中,注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml,混匀,待凝固后,倒置培养。每株试验菌平行制备2个平皿,测定菌液组的平均菌落数。

  供试品对照组:取1:10的供试液,以稀释液代替菌悬液同试验组操作,测定供试品对照组的平均菌落数。
 

  实验结果:

  各菌株回收比值=(试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。

  结果见表4。
 
  由上表4可见,取1:10的供试液,用平皿法时,白色念珠菌和黑曲霉2个菌株3次试验的回收均在0.5~2范围内,表明本品的霉菌和酵母菌总数可用平皿法检查(即1:10的供试液,1ml/皿)。
 

  注1:需氧菌计数方法适用性试验需要做五株菌的回收实验,霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验需要做两株菌的回收实验。其中白色念珠菌及黑曲霉在两个适用性试验中均需验证。这也与中国药典2015版将采用生物学分类的概念(细菌数、霉菌和酵母菌数)改为按照微生物生长需要的营养条件的不同进行分类的概念(需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数)相一致。

 
  四、控制菌检查方法适用性试验
  大肠埃希菌检查

  各取1:10的供试液10ml、每1ml含菌量不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml,分别接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中,按大肠埃希菌的检查法试验。

  结果见表5

  由上表5可见,本品的大肠埃希菌检查培养基体积应不少于100ml。

 
  结论:
  取本品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,振摇使分散,静置5分钟,取上清液作为1:10的供试液。取1:10的供试液适量,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进一步10倍系列稀释制成1:1000的供试液。

  需氧菌总数 取1:1000的供试液1ml,照平皿法检查。

  霉菌和酵母菌总数 取1:10的供试液1ml,照平皿法检查。

  大肠埃希菌 取1:10的供试液10ml,接种至不少于100ml胰酪大豆胨液体培养基中,依法检查。
 

  注1: 方法适用性试验在制定方案是要充分考虑供试品特性、供试液制备方法、抑菌作用的消除方法等。

  注2:方法适用性试验要从最低稀释级开始。

  注3:对于适应症明确有抗菌活性的药品建议选择一到两株试验菌株进行预实验,但需将试验结果完整记录。

  注4:一般需证明该稀释级没有适宜消除供试品抑菌活性的方法,才选择更高稀释级进一步试验。

  注5:当方法在不同实验室之间进行转移、再确认时,为避免滤膜的直径、材质对方法重现性的影响,方法中应尽可能明确滤膜的材质和尺寸,以满足方法转移的需要。

  注6:无论是采用一批样品进行3次试验,还是采用3批样品各进行一次试验,其目的都是为了说明操作中样品的抑菌性是否存在消除不彻底的现象,保证方法的重现性。







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