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浅谈微生物鉴定及其应用

2018-10-11 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑微生物 浏览:
作者:广州市药品检验所/陈伟盛
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权

 
编者按:微生物鉴定在药品检验和微生物污染控制中起着越来越重要的作用。然而,面对五花八门的鉴定手段,面对不断更新的药典要求,我们如何才能摆好正确的鉴定姿态?今天,我们有幸请来广州市药品检验所陈伟盛老师对微生物鉴定及其运用进行剖析。


  前言 
  微生物鉴定相信大家都很熟悉,自从《中国药典》2015版实施以来,微生物鉴定已经从2010版的可选项,发展到必选项,它成为了开展药品微生物检验的必要技术。但是由于微生物鉴定自身的特点,并非是一项固定技术,而是需要从目的出发选择技术,因此对人员的经验与理论要求比较高,导致了这一技术在药品微生物检验中的应用经常不到位,要么花了大价钱没有达到目的,要么开展了合理工作忽略了合理分析。

  今天,笔者和大家探讨以下微生物鉴定及其应用。

 
  1. 法规情况     
  首先就拿最为熟悉的《中国药典》作介绍,在2015版新增了<9204>微生物鉴定指导原则,在<9204>阐述了其适用范围是为“检出微生物的鉴定提供指导”,并且明确“微生物鉴定需达到的水平视情况而定”。在《中国药典》其他相关通则也作了明确规定,如<1106> “发现疑似菌落需进行鉴定”;<1101>“阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重做”;<9205>“建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定”。由于2015版药典与国际药典协调一致,在USP41的<1113>Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing中也有与《中国药典》类似或相同的表述。
 
  这说明了从法规角度来说,微生物鉴定是药品微生物检验中必不可少的一项技术,如果不具备微生物鉴定能力,就无法完成全部法定的微生物检验。
 
  2. 定义
  要把微生物鉴定这一技术使用到位,首先要知道微生物鉴定的准确定义。在《中国药典》是这样表述:“通过对未知微生物的特征测定,对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分,或属、种及菌株水平确定的过程”。从这个定义上看,微生物鉴定本身就区分和确定微生物的过程,并且从浅到深有各种水平。
 
  而USP中没有单独定义,但是有3个与鉴定相关的名词解释:Classification、Identification、Characterization。Classification是指通过相似度把微生物插入发育树中,即聚类分析;Identification是指归类微生物属于哪个“界、门、纲、目、科、属、种、亚种”;Characterization是指只归类微生物的有用信息,可不用进行Identification,通过微生物信息的分析以达到预设目的。笔者认为这个两个法规的定义均说明只要能把微生物区分,都属于微生物鉴定,至于区分的程度就取决于实验的目的。
 
  当我们深入认识微生物鉴定的概念之后,就可以发现微生物鉴定并不是深不可测,鉴定可以浅至形态、显微镜,深至蛋白、全序列。例如:通过平皿菌落颜色的不同区分微生物;通过全基因组的差异区分微生物,均属于微生物鉴定。只是这样的鉴定是否能达到你预设的目的,或者说的鉴定策略是否适合你预设的目的。因此微生物鉴定的立足点是预期目的,没有目的的鉴定是没有意义的,也无法开展。
 
  3. 微生物鉴定的应用
   把微生物鉴定说明白了,那应该如何合理运用它来为我们的微生物检验服务呢?根据《中国药典》<9204>,一般的药品微生物药品检验有3个目的:
 
  1、满足控制菌的鉴定确认要求;

  2、判断检验假阳性的要求;

  3、环境风险评估的要求。

 
  基于这3个不同的要求有不同程度的微生物鉴定。笔者认为,如果套用USP的概念,这3个要求的鉴定程度分别是Identification、Classification和Characterization。对于第一个目的,是最为传统的微生物鉴定需求,就是USP中所说的Identification,因此需要一个能到达种的鉴定系统,完全可以参考<9204>中的《伯杰氏系统细菌学手册》或市面上基于微生物生化反应的商业鉴定系统即可。而对于后面两个目的,由于需求比较复杂,同时为了说明微生物鉴定的应用是因目的而定的,并非鉴定程度约深越好,笔者在这里分享2个微生物鉴定的应用案例,以具体说明。
 

  案例1:假阳性结果判定
  实验员在局部百级背景万级的洁净环境下,采用薄膜过滤法对两个厂家不同批次共14批药品进行微生物限度检查。营养琼脂培养基平板在35℃±1℃培养72h,14批样品中有4批样品微生物限度检查结果细菌数不符合规定,检出菌结果,见表1。

 
  
样品检出菌(表1)
 
  检验操作过程中,为了确定该次微生物限度检查是否存在交叉污染,同时对洁净室环境及人员进行监控,包括对百级工作区及万级背景区进行表面菌及沉降菌采集,在进入洁净室前后对人员手套进行表菌采集,最终收集到6株环境菌,见表2。
 
环境及人员监控菌(表2) 
 
  在这里必须提醒一下,任何微生物的鉴定都是从菌落形态开始,这是必须的。因此从表1和表2的形态结果可以看出,不符合规定的4批样品菌落形态十分相似,且在环境菌中也发现与样品菌落极其相似的菌落(编号H06)。(注:其实在形态已经提示有污染风险!)
 
  对4株样品菌及6株环境菌进行革兰氏染色,并观察其显微形态。结果显示4株样品菌和1株环境菌(编号Y01~Y04、H06)均为革兰氏阴性杆菌,其氧化酶试验均呈阳性,且显微镜形态也极其相似。其余5株环境菌(编号H01~H05)均为革兰氏阳性球菌。(注:假阳性的风险继续提高!)
 

  对分离得到的10株菌株采用进行生化鉴定(Identification)和基因分类(Classification)结果见表3和图1。综合表3和图1的结果,可以判定样品的4株菌和其中的一株环境菌同源,即样品在微生物限度检验的实验过程中受到交叉污染,样品的不符合规定为“假阳性”。综合上述分析,推断四批样品的微生物污染是通过实验人员的手套进行传播的,在实验过程中,实验人员应注意严格遵守微生物限度检查标准操作规程,注意取膜操作,避免对样品造成交叉污染,影响实验结果的准确性。

 
 
鉴定结果(表3)
 
 
 
基因分类(图1)
 
  案例总结:在一些特殊的个案里,如本案例。由于微生物污染比较单一,菌落形态已经可以提示风险,甚至达到判断假阳性的目的,在我们常用的生化鉴定的水平上已经可以完全得到样品受人员污染的结果,基因分类结果只是更深入的证明了生物鉴定水平的正确性。因此在实际的分析中,微生物鉴定是不妨从简单做起,这样可以在合理成本内完成假阳性的判断目的。
 
  案例2:洁净室风险评估
  为了解洁净室生物负载情况,对洁净室主要区域(微生物限度检查、无菌1室、无菌2室、阳性接种)及进入该区域人员的浮游菌和表面菌进行采集,3个月/次,历时3年。取经过纯化并培养24~48小时的纯培物,对其进行革兰氏染色,确定微生物形态,然后根据形态进行氧化酶试验和过氧化氢酶试验。最后对结果进行分类汇总,获得两个饼图和一个汇总表。

  (注:1、在显微镜下可以区分酵母、霉菌、葡萄球菌、微球菌、芽孢杆菌;2、氧化酶阳性为非肠道菌,阴性为肠道菌;过氧化氢酶阳性为葡萄球菌,阴性为链球菌)

 
 
 
鉴定汇总表

  对上述图表进行分析,发现细菌占了鉴定菌株的95%,洁净室的生物负载主要是细菌为主,其中以革兰氏阳性菌为主,占了79%,在革兰氏阳性菌中以球菌数量最多,占了所有菌株的66%;其次是革兰氏阴性菌,占了16%,在革兰氏阴性菌中未检出球菌。再根据表中数据,可以了解到微球菌与葡萄球菌是实验室的常规菌株,这些微生物存在于各实验区域和人员表面,是洁净室中的常态菌。同时可以发现霉菌和酵母只在实验后人员表面发现,故此可以推断霉菌和酵母不是洁净室中的常态菌,是人员在进行实验后从样品表面带入的,很有可能是外源性污染的菌株。
 
  对上述的结果进行深入分析,发现环境主要的微生物负载是革兰氏阳球菌(微球菌和葡萄球菌),如不合格样品出现实验室污染,则污染革兰氏阳性球菌的风险最大。并且微球菌属和葡萄球菌属存在于每个实验区域,而且形态相同或相似,因此这些菌之间存在同源性的可能非常大,就说明了这些微生物可以通过系统或洁净室内的人流和物流,传播到不同的实验区域中,这样就有可能存在微生物交叉污染的风险,在进行实验时需要注意动作幅度,不要经常进出不同的实验区域。减少交叉污染的风险。
 
  此外洁净室还检出真菌,虽然洁净室真菌检出率虽然只有5%,但是真菌抗逆性比较强,洁净室一旦大面积出现真菌就难以清除,是洁净室污染严重程度最高的风险,需要特别重视。从人员表面的微生物信息可以推测,人员进入洁净室后,在实验前没有接触到外来物品,因此在人员表面只采集到与洁净室常态菌一致的微生物。然而实验后,在人员表面除了采集到洁净室常态菌外,还采集到了霉菌和酵母,这说明了人员在实验时接触到的外来物品(样品和器材)表面有霉菌与酵母存在,反映了洁净室在样品消毒存在风险,会有引入霉菌与酵母的潜在风险,由于霉菌与酵母的污染是属于严重风险,需要马上采取措施。需要考察现在的样品表面消毒与自净措施是否足够,如果无法对样品进行彻底消毒,就需要规定在进行实验时,每隔一段时间用75%酒精对实验人员的手部进行消毒,尽可能降低真菌污染的风险。
 
  案例总结:以上案例是虽然微生物鉴定程度浅,但是对微生物鉴定信息进行合理分类汇总后,依然可以完成简单的的风险评估,说明善于处理微生物鉴定信息也可以在没有大型仪器的情况下完成环境微生物的简单评估。
 

  结语
  通过讨论与分享,笔者并不是说微生物鉴定总要往浅的做,笔者只是想说明微生物鉴定没有最深与最浅,只有鉴定程度恰到好处,达到预期目的,才是一个好的微生物鉴定。微生物鉴定是一个基于目的而出发,笔者认为它是一把双刃剑,如果使用得当,它就是一把开展微生物分析及风险评估的利剑;如果使用不当,它就是一把不断浪费自身检验资源的封喉剑。在使用微生物鉴定之前,首先要明确自己的鉴定目的,然后善于把鉴定信息进行分类汇总,最终达到预期目的。通过此次分享,希望能帮助更加了解微生物鉴定及其应用,把它使用得更加合理、恰当。




 
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