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制药用水的微生物控制后续--浅谈生物膜

2018-05-02 分类:原创文章 作者:Array 来源:中仑研究院 浏览:
作者:雨花石
编辑:北京中仑工业微生物研究院
版权:原创文章,独家版权



  生物膜(biofilm)在制药行业不是一个新出现的问题,其一旦形成,后续的处理措施将会非常困难。尽管如此,由于种种原因,生物膜的问题却总是被忽视,或者被选择性盲视。笔者根据多年的微生物从业经验,在此浅谈生物膜的形成及控制。
 
  一、引子
 
   
  在开始介绍生物膜之前,我们有必要先了解一下生物膜的危害及严重性。这里,我们先了解一封FDA在2016年发给英国制药巨头GSK的警告信:
  
  Failure to adequately investigate critical deviations and implement corrective and preventive actions.
      
  关键偏差未能彻底调查并采取CAPA

  A. Microbial contamination in (b)(4) water systems

  A. 水系统中的微生物污染

  From April 20, 2014, to February 17, 2015, you investigated at least 25 breaches of the alert level ((b)(4) colony forming units) or action level ((b)(4) colony forming units) for microbial contamination in your water system loops in Building (b)(4). You used water produced from this system to manufacture (b)(4) API. Of note, you identified Burkholderia cepacia, a waterborne organism known to contribute to biofilm formation in water systems, in several of your alert-level and action-level investigations.

  从2014年4月20日至2015年2月17日,你们调查了水系统循环管路微生物检测的至少25个超警戒限或超行动限。你们使用此水系统中的水生产API。值得注意的是,在你们的很多超警戒限和超行动限的调查中鉴别出了洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia),这是一种水生的已知在水系统中可以促进生物膜形成的微生物。

  Your investigations failed to adequately establish root causes. In 16 of the 25 investigations, you concluded that the root cause was sampling error but had no supporting evidence. You did not determine a root cause in the remaining nine investigations. Our inspection also found that you were not sanitizing the (b)(4) water system loops (b)(4), as required in your procedure PAA219 Operation & Maintenance for (b)(4) Plant (b)(4) Water System.

  你们的调查未能调查出根本原因。25个调查中的16个,你们把根本原因归结于取样的原因却没有支持的证据。其他9个调查未确定根本原因。检查员也发现你们未按照程序“PAA219水系统的运行和维护”进行水系统循环管路的消毒。

 
  B. (b)(4) API batch (b)(4) with out-of-specification bioburden

  B. API的微生物负载OOS

  Our investigators found that three of the (b)(4) of (b)(4) (batch (b)(4)) had bacterial counts (bioburden) exceeding your specification. (b)(4) had more than (b)(4) colony forming units of Sphingomonas paucimobilis per milliliter of product. Sphingomonas paucimobilis, an opportunistic pathogen, is one of the organisms you identified in the water system used to manufacture this batch. Notably, Sphingomonas paucimobilis was also found in (b)(4), but this (b)(4) was released based on passing microbial count testing.

  检查员发现3批API的微生物计数(微生物负载)超出你们的限度标准。产品xxx中的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)的菌落形成单位超过xxx CFU/L。少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)是一种条件致病菌,也是你们在供应产品生产的水系统中鉴定出的菌。尤其,你们在xxxz中也发现了少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis),但是这个批次却被放行了,因为其微生物计数结果符合限度标准。

  Following an investigation, your firm elected to reject the (b)(4) that failed microbiological quality control testing. However, microbial contamination by its nature rarely occurs uniformly. Therefore, rejecting the specific (b)(4) that failed final QC testing, while releasing the remaining (b)(4), may not prevent exposure of customers to potentially objectionable contamination.

  根据调查,你们根据微生物测试结果拒收了xxx。然而,微生物污染本质上是不均匀的。因此,拒收不符合微生物限度标准的批次而放行其他批次,可能会导致患者受到潜在的微生物污染的风险。

  警告信的A部分,GSK把水系统的大部分异常结果归结于取样的原因,然而,FDA检查员注意到,被检出的微生物鉴别出了洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia),并在警告信中明确提出其可以促进生物膜的形成,因而不认可该调查结论。另外,FDA在警告信中提到了水系统未按照既定的程序进行消毒,则是从另外一个方面证实了其对水系统中形成生物膜的担忧。如果B部分尚未涉及到产品安全性能的话,那么,B部分则是把水系统的微生物污染与产品的微生物风险进行了直接的关联。产品中出现的微生物为水系统中鉴定出的菌,则表明水系统的微生物污染已影响到产品的质量和患者的安全。

 
  二、法规要求
  警告信也许不能完全代表法规的期望,也许也不能表明问题的普遍性。但是,欧美的监管部门对于生物膜的要求却是很早就已经开始的。

  事实上,在1993年的超纯水指南中,FDA就已经要求对水系统中的生物膜控制,并简要描述了水系统中生物膜的形成过程:

  Organisms exist in a water system either as free floating in the water or attached to the walls of the pipes and tanks. When they are attached to the walls they are known as biofilm, which continuously slough off organisms. Thus, contamination is not uniformly distributed in a system and the sample may not be representative of the type and level of contamination. A count of 10 CFU/mL in one sample and 100 or even 1000 CFU/mL in a subsequent sample would not be unrealistic.

  水系统中的微生物以浮游的形成存在,或黏附于管道和储罐的内壁。当微生物黏附与内壁时,其被称为生物膜,其可以持续释放出微生物。因此,微生物污染在水系统中不是均匀分布的,取样的结果可能不能代表污染的类型和污染水平。一个样品的微生物结果是10CFU/mL,而其后的样品为100甚至1000CFU/mL不是没有可能的。

 
  
 
  
USP<1231>则对生物膜进行了更加详细的描述

  欧盟则在2016年发布了“The Risk of Biofilm”(生物膜的风险)一文,描述了水系统中生物膜的特性和危害,并强调了水系统的设计和维护对预防生物膜形成的重要性。并且,在2017年发布的欧盟GMP附录1的征求意见稿中,在水系统部分,明确提出了对生物膜的要求:

  To prevent the formation of biofilms, sterilization or disinfection or regeneration of water systems should be carried out according to a predetermined schedule and also when microbial counts exceed action and alert limits. Disinfection of a water system with chemicals should be followed by a validated rinsing procedure. Water should be analyzed after disinfection/regeneration; results should be approved before the start of use of the water system.

  为防止生物膜的形成,水系统的灭菌、消毒或者再生应按照预定的计划进行,以及在微生物计数超出警戒限/行动限时进行。水系统在化学消毒后应使用经验证的清洗程序进行清洗。在消毒/再生后应进行水质监测,监测结果被批准后水系统方可被放行使用。

  由此可见,欧美均对生物膜,尤其是水系统中的生物膜有着明确的要求。

  三、什么是生物膜
  根据 USP<1231>的定义,生物膜为:
 
  A biofilm is a three-dimensional structured community of sessile microbial cells embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS). Biofilms form when bacteria attach to surfaces in moist environments and produce a slimy, glue-like substance, the EPS matrix, while proliferating at that location. This slimy matrix facilitates biofilm adhesion to surfaces as well as the attachment of additional planktonic cells to form a microbial community.

  生物膜是固着的微生物细胞内嵌在胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)中形成的三维结构。当细菌附着到潮湿环境的表面并且产生黏滑的、胶状物质(EPS),且细菌在其中增殖时,会形成生物膜。这一黏滑的基质促进生物膜附着到表面,同时也会吸附其他浮游细胞,从而形成一个微生物群落。

  在制药行业,提到生物膜,一般都会将其与水系统联系在一起。当前的法规、指南等也多是针对水系统提出控制的要求。然而,生物膜不是水系统的专利,更不是制药行业的专利。事实上,潮湿的环境表面均有产生生物膜的风险,如牙齿斑、家用冰箱、医疗器具表面等均会产生生物膜。在制药生产环境的很多环节也均会产生生物膜,包括设备表面、产品溶液、水槽、地漏、水系统的制备单元、循环管路、用水点等均有生物膜的风险。水系统因其是密闭的系统,生产生物膜一是不易被发现,二是产生的生物膜不易去除,故其成为了重点关注的对象。

  以下的内容,如无特别说明,均是针对水系统中的生物膜。

  四、生物膜的形成
  
生物膜的形成一般分为4个阶段:

 
 
 
  备注:图片来源PDA TR69 – 制药生产运营中的微生物负载和生物膜的管理

  1. 微量的有机化合物和无机化合物在表面的吸附,形成初始的膜。这一过程可能成为微生物初始识别和吸附的信号;

  2. 对流作用和/或驱化作用介导的微生物可逆吸附;

  3. 微生物的表面分化,或成为生长繁殖;

  4. 合成EPS,稳定固着的细胞。

  某些文献包含了第5个阶段,即生物膜中释放出浮游的微生物。

  生物膜一旦形成后,其可以吸附水中其他的浮游微生物,并为这些微生物提供养分和生长环境,使得生物膜内形成一个复杂的微生物群落。这些微生物之间又存在复杂的相互作用,从而使得生物膜的性质变得更加复杂。

 
  五、生物膜的特征和危害
  生物主要有EPS和生长于其中的微生物组成。在生物膜形成的初期,微生物与表面的吸附是可逆的、作用较弱的。然而,某些微生物在吸附后可以分泌出特定的胞外物质,促进这种吸附作用,这种物质的主要成分是多糖,其具有粘性,也是EPS的主要组分。当然,EPS还含有其他成分,包括蛋白质、DNA等其他物质。

  EPS对微生物的作用是显而易见的:

  ●EPS可以为微生物提供保护的屏障,保护其被化学物质和热的伤害。我们知道,消毒剂要杀灭微生物,需要有足够的浓度和接触时间。EPS可阻碍消毒剂与微生物的接触,从而保护微生物免受消毒剂的杀灭作用。同时,生长于其中的微生物可能会合成特定的酶以降解消毒剂;而热力学消毒则需要被消毒对象达到足够的温度和维持足够的时间。EPS同样可降低热传递作用,降低热力学对微生物的作用;

  ●EPS可以为微生物提供养分。制药用水,尤其是纯化水和WFI,其有机化合物和无机化合物的浓度很低,不利于微生物的生长和繁殖。然而,EPS提供了一个营养丰富的内环境。即使其中的微生物死亡,细胞裂解物也可被固定在EPS内,用作活细胞生长的养分;

  ●EPS可以释放出活的微生物,这些微生物很多具有生物膜的形成特性,从而在水系统的其他部位形成新的生物膜。


  生物膜对水系统的影响包括:

  ●造成水系统的微生物负载超标,对产品质量和患者安全带来影响;

  ●水系统中的微生物主要为革兰氏阴性菌,菌体在生长繁殖时及死亡裂解后可释放出内毒素;

  ●微生物可释放出外毒素-水溶性蛋白;

  ●水系统管路的腐蚀;

  ●影响制水系统的功能和正常运行。

 
  六、生物膜的检测
  当前,制药用水的微生物检测均是针对浮游微生物进行取样和检测的方法,即在水系统的取水点和/或用水点取样后,采用薄膜过滤法,将滤膜贴于R2A培养基上进行培养和计数。这种经典的微生物检测方法无法对生物膜进行针对性的检测。PDA TR69列出了一些可用于生物膜取样的方法,如下:
 

  这些方法均需要将取样对象敞开或者拆解,如表格中对O型圈的超声取样、玻璃珠的漩涡震荡等。对于水系统的内表面,也可用棉签擦拭进行取样,取样棉签可直接涂布于平板,或将均分散至溶液后使用薄膜过滤法进行检测,用于定性或者调查测试。

  七、生物膜的预防
  当前,水系统的生物膜主要预防控制为主,一旦产生,很难去除,尤其对一些结构复杂的水系统处理单元,如RO膜、EDI等。这些措施包括:

  ● 水系统的设计
 
  包括材质、湍流、表面粗糙度、坡度、死角等是微生物控制的主要参数。

  水系统的储罐和管路均为316L不锈钢材质,其应具有高温、酸、碱的耐受性。
纯化水和WFI应保持湍流,ISPE要求湍流区的雷诺系数应高于2100,回水的流速不低于3英尺/秒(约1米/秒),以保持循环管路的湍流状态,最大程度降低管壁层流的厚度,增强水流的剪切力,降低生物膜的形成几率。对于分配系统的坡度,ISPE则要求最小为1/16 in./ft (0.52 cm/m),对于盲管,ISPE则要求符合6D法则。


  ● 水系统的消毒
 
  水系统,尤其是杂质较少的纯化水系统,中的微生物主要是假单胞菌类可以形成生物膜的微生物,这类微生物对热敏感,65℃下的D值不超过5秒,因此热消毒(通常80℃)很容易杀死此类微生物。然而,对于已形成生物膜的微生物群落,热消毒仅可以杀灭活的微生物,但却无法消除生物膜中的EPS。当消毒结束后、水系统运行时,EPS可以继续吸附水系统中的微生物,并使其在内部生长繁殖。因此,除了热消毒外,还需要一定周期的化学消毒,或者化学清洗。其中,酸洗可以去除水系统内表面的无机物,而碱则对有机物的去除比较有效。各种消毒方式联合使用,对于生物膜的控制效果更好。

  除了定期的消毒,水系统还需要定期的再生,定期进行酸洗钝化,以避免水系统的内表面被腐蚀。
 

  ● 水系统的维护
 

  水系统的维护,尤其是处理单元的维护,对于防止生物膜的形成也是非常关键的。水系统的处理单元,如活性炭、离子交换树脂、RO膜、EDI等,这些单元既可以去除原水中的微生物,同时,累积于表面的有机物又成了微生物滋生和繁殖的最佳场所,有助于生物膜的形成。笔者曾经碰到过RO膜和EDI模块分别产生生物膜的情况,并影响到了产水的微生物水平。各种处理方式均无效果,最终不得不更换了这两个模块。

  另外,用水点的维护也是非常重要的。当前的水系统使用点大多使用隔膜阀,其由于构造的原因,易于在使用点的外侧形成生物膜,从而造成某些用水点的微生物水平持续高于其他水点。为此,某些公司指定了定期更换隔膜片的维护策略,虽然成本较高,但对于生物膜的预防效果却是显著的。

  从水系统的设计、建造、使用、维护等整个生命周期进行生物膜的预防,是生物膜控制的关键部分。而生物膜一旦形成,一方面很难定位到生物膜形成的精确位置,另外一方面由于水系统的密闭性,很难使用机械处理的方式去除,带来了后续处理过程的难度。预防才是控制的跟本。

 
  以上是笔者对于制药行业,主要是水系统中的生物膜的理解,希望对制药的同行有一定的参考价值,也希望行业内的专家通过公众号与作者联系,一起深入探讨生物膜的控制。
 
 
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